Занятие № 2

Тема:  СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ. КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ИХ ДЕЙСТВИЯ

Вопросы для подготовки

1. Ферменты. Определение. Значение ферментов в организме.
2. Структура ферментов. Кофакторы и их характеристика.
3. Свойства ферментов, сходные со свойствами минеральных катализаторов.
4. Структура активного центра простых и сложных ферментов:

4.1. Якорный (контактный)участок: структура и функции;

4.2. Каталитический участок: структура и функция

1. Механизм действия ферментов. Понятие об энергетическом барьере и энергии активации.
2. Специфические свойства ферментов:

6.1. Зависимость активности ферментов от температуры;

 6.2.Зависимость активности ферментов от реакции среды;

     6.3.Специфичность действия.

1. Активаторы ферментов. Виды активации. Механизмы, примеры.
2. Ингибиторы ферментов. Виды ингибирования. Механизмы, примеры
3. Современная классификация и номенклатура ферментов. Характеристика ферментов каждого класса.
4. Качественные методы оценки действия ферментов.

11.Внутриклеточная локализация ферментов.                                          

                                            Практическая часть

         Изучение влияния различных факторов на активность ферментов.             

Протокол № 2

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ

 α – АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

        Цель работы: доказать влияние температуры, рН среды, активаторов и ингибиторов на активность  a-амилазы  слюны, исследовать специфичность её  действия.

         Методы: 1.Ферментативный гидролиз крахмала под действием  a-амилазы слюны в присутствии различных факторов.

2. Иодная проба (проба Люголя).

    3 .Проба Фелинга.

Принцип методов и теоретическое обоснование практических работ:

1. a-амилаза слюны катализирует гидролиз внутренних  a-1,4-гликозидных связей крахмала и гликогена с образованием промежуточных (декстрины) и конечных продуктов (мальтоза, изомальтоза и глюкоза).

О проявлении ферментативной активности  a-амилазы слюны свидетельствуют:

а) исчезновение субстрата (крахмала), обнаруживаемое с помощью йодной пробы (пробы Люголя). Нерасщепленный крахмал дает с йодом синее окрашивание, амилодекстрины - фиолетовое, эритродекстрины - красно-бурое, ахродекстрины и конечные продукты гидролиза - желтое (цвет йода в воде, т.е. окрашивания не дают).

б) появление продуктов гидролиза - мальтозы, изомальтозы, глюкозы, обнаруживаемое с помощью пробы Фелинга. В основе этой пробы лежит окислительно-восстановительная реакция между глюкозой (мальтозой, изомальтозой или любым другим углеводом, имеющим свободный полуацетальный гидроксил) и ионами Сu2+ (голубого цвета), входящими в состав реактива Фелинга. Углевод за счет свободного полуацетального гидроксила окисляется до соответствующей кислоты (глюконовой, мальтобионовой и т.п.), а Cu2+ восстанавливается до Cu1+ (оранжевого цвета). Реакция идет при нагревании до 100оС.

1. Наибольшая активность a-амилазы слюны наблюдается при температуре 38-40оС. Этот интервал называется температурным оптимумом фермента. При кипячении слюны вследствие тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к изменению конформации и активного центра, происходит прекращение ферментативной реакции, о чем свидетельствует положительная йодная проба.
2. Оптимум рН для  амилазы слюны можно определить, анализируя результаты ее взаимодействия с крахмалом при различных значениях рН среды. Изменение концентрации протонов приводит к изменению степени диссоциации карбоксильных и аминогрупп  и третичной структуры фермента и следовательно, и заряда в якорном участке активного центра. Изменение конформации и заряда молекулы фермента, затрагивающие активный центр, обусловливают понижение ее активности.
3. Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его формированию (NaCl) или разрушению в результате денатурации (CuSO4).
4. a-амилаза гидролизует полисахариды до конечных продуктов (мальтоза, изомальтоза, глюкоза), но не оказывает никакого действия на дисахариды (сахароза, лактоза, мальтоза, изомальтоза).

3.1. Исследование влияния температуры на активность α-амилазы

1. В три пробирки прилить по 10 капель 10% раствора крахмала.
2. В 1-ю пробирку добавить 10 капель разведенной в 10 раз слюны.
3. Во 2-ю пробирку добавить 10 капель дистиллированной воды.
4. В 3-ю пробирку добавить 10 капель предварительно прокипяченной слюны.
5. Все пробирки инкубировать при 380С в течение 10 минут.
6. Содержимое каждой пробирки поделить на две части (при этом получится 6 пробирок: 1а и 1б, 2а и 2б, 3а и 3б).
7. В пробирки 1а, 2а и 3а добавить по 5 капель раствора Люголя (раствора йода в йодиде калия) для обнаружения субстрата амилазы - крахмала.
8. В пробирки 1б, 2б и 3б добавить по 5 капель реактива Фелинга и нагреть их на спиртовке для обнаружения конечных продуктов гидролиза крахмала.
9. Указать наблюдаемый эффект в каждой из пробирок и по наличию (отсутствию) субстрата (продуктов) действия амилазы сделать вывод о влиянии температуры на её активность.

№ пробирки	Наблюдаемый эффект	Вывод
1а	Проба Люголя
1б	Проба Фелинга
2а	Проба Люголя
2б	Проба Фелинга
3а	Проба Люголя
3б	Проба Фелинга

Вывод:  

3.2. Исследование влияния рН среды на активность α-αамилазы

1. В 1-ю пробирку прилить 2 мл буферного раствора рН 6,0.
2. Во вторую пробирку прилить 2 мл буферного раствора рН 6,8.
3. В 3-ю пробирку прилить 2 мл буферного раствора рН 8,0.
4. В каждую пробирку добавить по 1 мл 0,5% раствора крахмала.
5. В каждую пробирку добавить по 1 мл разведенной в 100 раз слюны.
6. Все пробирки инкубировать в течение 10 минут при температуре 380С.
7. В каждую пробирку добавить по 5 капель раствора Люголя.
8. Определить пробирку, в которой расщепление крахмала прошло наиболее глубоко и принять значение рН буферного раствора в этой пробирке за оптимальное для действия амилазы. Сделать вывод о влиянии рН на активность амилазы.

№ пробирки	Наблюдаемый эффект	Вывод
1 (рН 6,0)	Проба Люголя
2 (рН 6,8)	Проба Люголя
3 (рН 8,0)	Проба Люголя

      Вывод:

3.3. Исследование влияния активаторов и ингибиторов на активность

 α-амилазы

1. В три пробирки прилить по 1 мл разведенной в 40 раз слюны.
2. В 1-ю пробирку добавить 2 капли 1% раствора NaCl.
3. Во 2-ю пробирку добавить 2 капли 1% раствора CuSO4.
4. В 3-ю пробирку добавить 2 капли дистиллированной воды.
5. В каждую пробирку добавить по 5 капель 1% раствора крахмала.
6. 1-ю пробирку инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
7. 2-ю и 3-ю пробирки инкубировать в термостате при 38оС в течение 10 минут.
8. В каждую пробирку добавить по 5 капель раствора Люголя.
9. Отметить наблюдаемый эффект и на этом основании сделать вывод о влиянии NaCl и CuSO4 на активность амилазы.

 

№ пробирки	Наблюдаемый эффект	Вывод
1 (NaCl )	Проба Люголя
2 (CuSO4)	Проба Люголя
3 (Н2О)	Проба Люголя

Вывод:

 3.4. Исследование специфичности  действия a-амилазы

1. В две пробирки внести по 5 капель разведенной в 5 раз слюны.
2. В 1-ю пробирку добавить 10 капель 1% раствора крахмала.
3. Во 2-ю пробирку добавить 10 капель раствора сахарозы.
4. Обе пробирки инкубировать при 380С в течение 10 минут.
5. В обе пробирки добавить по 5 капель реактива Фелинга и нагреть их на спиртовке.
6. Исходя из наблюдаемого эффекта, сделать вывод о субстратной специфичности a-амилазы.

 

№ пробирки	Наблюдаемый эффект	Вывод
1 (крахмал)	Проба Фелинга
2 (сахароза)	Проба Фелинга

Вывод:

Контролирующие задачи

1. Некоторые животные зимой впадают в состояние парабиоза. Дайте биохимическое объяснение этому феномену.
2. Какие биохимические механизмы лежат в основе теплового удара, возникающего при длительном воздействии на организм высоких температур и сопровождающегося отключением сознания ?
3. Любой воспалительный процесс, развивающийся в ответ на внедрение микроорганизма в макроорганизм, сопровождается гипертермией (лихорадкой). Является ли эта реакция защитной и на что она направлена? Является ли она повреждающей для макроорганизмов и каковы последствия этого повреждения? Почему при температуре выше 40оС происходит отключение сознания? Какова должна быть лечебная тактика врача при ведении больных с гипертермией, диктуемая зависимостью активности ферментов от температуры?
4. Сульфаниламидные препараты назначаются при внедрении в макроорганизм патогенной микрофлоры с целью ликвидации причины острого воспаления. Применение этих препаратов строго регламентировано:

1. первая доза двойная (так называемая «ударная доза»);
2. промежутки во времени приема не более 4-х часов для обычных препаратов и не более 12-ти часов для пролонгированных (с продленным действием);
3. курс лечения не менее 6-ти дней.

Объясните биохимические механизмы, лежащие в основе действия сульфаниламидных препаратов. Почему необходимо неукоснительное выполнение регламента в назначениях? Какие следствия возможны при его нарушении?

1. Почему современные препараты, направленные на восстановление ферментативной активности, содержат поливитаминные комплексы в сочетании с микроэлементами?
2. Приём внутрь 30 мл метанола может привести к смертельному исходу. Это обусловлено тем, что в организме при участии алкогольдегидрогеназы он окисляется в токсичный формальдегид. Одним из методов лечения при отравлении метанолом является назначение внутрь или внутривенно этанола в дозах, вызывающих интоксикацию у здорового человека. Объясните, каков механизм этого способа лечения.